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Gewinnung von Mitochondrien aus Herzmuskel

Versuchsprinzip: Zur präparativen Gewinnung von Mitochondrien muss man Zellen oder Gewebe zerstören. In unserem Versuch geschieht das mit Hilfe eines Homogenisators, einem Teflon- oder Glasstempel, der eng in einem Glaszylinder geführt wird. Zellen, die durch Bewegen des Stempels zwischen Stempel und Glaswand geraten, werden durch die auftretenden Scherkräfte zerrissen. Das Homogenat wird durch niedertouriges Zentrifugieren von groben Zelltrümmern und den Zellkernen befreit Die im Überstand befindlichen Mitochondrien sedimentieren bei höherer g-Zahl. Sie stellen eine Roh-Mitochondrien-Fraktion dar, die noch durch Membranbestandteile der Zellen verunreinigt ist. Wir verwenden diese Rohfraktion zur Bestimmung der Succinat-Dehydrogenase-Aktivität.

Succinat wird durch Succinat-Dehydrogenase, ein FAD-abhängiges Enzym, zu Fumarat dehydriert. Das FAD übernimmt die Wasserstoffe und überträgt sie in vivo auf Ubichinon. In unserem Versuch bieten wir dem Enzym einen künstlichen Elektronen- und Wasserstoffakzeptor an, das Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). TTC geht bei Reduktion in eine Substanz über, die man Formazan nennt und die intensiv rot gefärbt ist. Die Messung der Extinktion des roten Farbstoffs erlaubt die Bestimmung der Reaktiongeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Bei welcher Substratkonzentration bestimmt man die Enzymaktivität?

Titel: Chemikalien

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Im Uhrzeigersinn von rechts:

  • Ethylacetat (organisches Lösungsmittel, Vorsicht Leichtentzündlich und Reizend!)
  • Trichloressigsäure (TCA) (starke organische Säure, Vorsicht Ätzend und Umweltgefährdend!)

  • Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) ist ein in Wasser löslichler Redoxindikator (Der Farbumschlag erfolgt bei einer Redox-Reaktion: Im oxidierten Zustand (Tetrazolium) ist der Indikator farblos, im reduzierten Zustand (Formazan) ist Indikator rot.

  • Succinat
  • Puffer

Titel: Homogenisator

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Auf dem Bild sieht man einen Homogenisator mit Kolben. Durch Bewegen des Kolbens, der eng vom Glasrohr ummantelt ist. wird das Gewebe zerkleinert und Zellen aufgebrochen. Es wirken Scherkräfte auf die zu zerkleinernden Proben ein.

Titel: Materialien

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

im Uhrzeigersinn von oben: Glaspipette mit Peleusball, Eppendorfständer mit Eppendorf-Reaktionsgefäßen (Eppis), Küvetten zum Messen von Lösungen im Fotometer und unten eine Automatikpipette mit aufgesteckter Pipettenspitze

Automatikpipette: Eine im Labor sehr gebräuchliche Pipette ist die Mikroliter- oder Kolbenhubpipette. Diese Pipetten werden benutzt, um kleine Volumina und sehr kleine Volumina (von 5 ml = 5000 µl bis 0,1 µl) zu dosieren. Kolbenhubpipetten arbeiten nach dem Verdrängungsprinzip. Ein beweglicher Kolben verdrängt beim Herunterdrücken die unter ihm liegen Luftsäule, bzw. zieht die Luftsäule in der Aufwärtsbewegung mit sich nach oben, und dadurch auch die zu pipettierende Flüssigkeit in die aufgesteckte Pipettenspitze. Diese Pipetten arbeiten mit aufsteckbaren Pipettenspitzen, in welche die gewünschte Flüssigkeit aufgesaugt wird. Zum festen Aufstecken steckt man die Spitze auf die Pipette auf und dreht sie mit einer Vierteldrehung fest.

Küvette: Eine Küvette ist ein Gefäß mit planparallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. Küvetten gibt es in unterschiedlicher Qualität, je nach Verwendungszweck. Üblicherweise bestehen sie aus Glas oder Kunststoff. Für Wellenlängen, die unter 200 nm liegen, werden spezielle Quarzküvetten benötigt.

Peleusball: verfügt über drei Ventile für folgende Funktionen:

  • Ventil A (Ansaugen/Ausdrücken) oben: Luft ausdrücken zum Ansaugen
  • Ventil S (von Saugen) unten: flüssiges Medium in Pipette ansaugen
  • Ventil E (von Entleeren) seitlich: Pipetteninhalt kontrolliert abgeben

Anwendung: Zunächst wird der Peleusball auf die Pipette aufgesetzt. Dabei die Pipette kurz halten und waagerecht zum Körper, um Verletzungen zu vermeiden. Dann öffnet man das Ventil A durch Zusammendrücken und drückt, während das Ventil gedrückt gehalten wird, die Luft aus dem Gummiball. Jetzt steht ein Unterdruck zur Verfügung, mit dem Flüssigkeit angesaugt werden kann. Das Ansaugen erfolgt durch kontrolliertes Zusammendrücken des Ventils S, das Ablassen von Flüssigkeit durch Betätigen von E. Die Pipette beim Entleeren mit der Spitze an die Gefäßwand halten.

Glaspipette: Vorsicht beim Ablesen der aufgezogenen Flüssigkeitsmenge! Regeln zum Ablesen des Meniskus beachten.

Titel: Zentrifuge

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Die Zentrifuge wird nur vom Betreuer beladen und bedient!