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Bestimmung der Anreicherung des Enzyms Lactatdehydrogenase

Aussalzen ist ein Prozess, bei dem wasserlösliche Proteine durch eine Salzzugabe ausgefällt werden. Das gebräuchlichste Salz ist Ammoniumsulfat. Durch das Lösen des Salzes binden die Ammouniumsulfat-Moleküle eine große Anzahl von Wasser-Molekülen. Je mehr Salz gelöst wird, desto weniger Wassermoleküle stehen für die Wechselwirkung mit den Proteinen zur Verfügung. Bei steigender Salzkonzentration können ab einem gewissen Punkt unterschiedliche Proteine nicht mehr in Lösung gehalten werden und bilden einen Niederschlag. Das Aussalzen entspricht also im wesentlichen einer Dehydratation. Da sich Proteine in ihren Lösungseigenschaften unterscheiden, können sie durch diese Methode voneinander getrennt werden (Salz-Fraktionierung). Bestimmte Proteine können jedoch bei zu langsamer oder zu schneller Salzzugabe leicht denaturiert werden. Neben der Salzmenge spielt also auch die Geschwindigkeit der Dehydration eine entscheidende Rolle. In der Praxis wird das Salz oftmals in trockener Form und in kleinen Mengen zugegeben. Erst nachdem sich das Salz vollständig gelöst hat, wird eine neue Salzportion zugegeben. Bei kleinen Probenvolumina wird das Salz in Form einer gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung tropfenweise beigegeben. Jedoch ist zu beachten, dass sich das Volumen der Probelösung entscheidend vergrößert. Bei einer 50% igen Sättigung wird das Probenvolumen verdoppelt. Die ausgefällten Proteine können durch zentrifugieren isoliert werden. Das zugegebene Salz kann durch eine nachgelagerte Dialyse wieder entfernt werden.

Titel: Chemikalien

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Im Uhrzeigersinn von oben:

  • Pyruvatlösung
  • Biuretlösung (Nachweisreagenz für Peptidbindungen - Vorsicht enthält gesundheitsschädliches Kupfersulfat!),
  • Puffer
  • destilliertes Wasser
  • Trichloressigsäure (TCA)(Vorsicht: organische Säure; Ätzend und Umweltgefährlich!)
  • Kalilauge (KOH) (Vorsicht: starke anorganische Base; Ätzend!)

Titel: Fotometer

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Das Fotometer (alte Schreibweise: Photometer) ist ein Instrument zur Lichtstärkenmessung. Es dient zur Bestimmung von Konzentrationen von Stoffen in Lösungen (Lambert-Beer'sches Gesetz).

Die Bedienung erfolgt durch den Assistenten.

Titel: Materialien 1

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

im Uhrzeigersinn von oben: Glaspipette mit Peleusball, Eppendorfständer mit Eppendorf-Reaktionsgefäßen (Eppis), Küvetten zum Messen von Lösungen im Fotometer und unten eine Automatikpipette mit aufgesteckter Pipettenspitze

Automatikpipette: Eine im Labor sehr gebräuchliche Pipette ist die Mikroliter- oder Kolbenhubpipette. Diese Pipetten werden benutzt, um kleine Volumina und sehr kleine Volumina (von 5 ml = 5000 µl bis 0,1 µl) zu dosieren. Kolbenhubpipetten arbeiten nach dem Verdrängungsprinzip. Ein beweglicher Kolben verdrängt beim Herunterdrücken die unter ihm liegen Luftsäule, bzw. zieht die Luftsäule in der Aufwärtsbewegung mit sich nach oben, und dadurch auch die zu pipettierende Flüssigkeit in die aufgesteckte Pipettenspitze. Diese Pipetten arbeiten mit aufsteckbaren Pipettenspitzen, in welche die gewünschte Flüssigkeit aufgesaugt wird. Zum festen Aufstecken steckt man die Spitze auf die Pipette auf und dreht sie mit einer Vierteldrehung fest.

Küvette: Eine Küvette ist ein Gefäß mit planparallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. Küvetten gibt es in unterschiedlicher Qualität, je nach Verwendungszweck. Üblicherweise bestehen sie aus Glas oder Kunststoff. Für Wellenlängen, die unter 200 nm liegen, werden spezielle Quarzküvetten benötigt.

Peleusball: verfügt über drei Ventile für folgende Funktionen:

  • Ventil A (Ansaugen/Ausdrücken) oben: Luft ausdrücken zum Ansaugen
  • Ventil S (von Saugen) unten: flüssiges Medium in Pipette ansaugen
  • Ventil E (von Entleeren) seitlich: Pipetteninhalt kontrolliert abgeben

Anwendung: Zunächst wird der Peleusball auf die Pipette aufgesetzt. Dabei die Pipette kurz halten und waagerecht zum Körper, um Verletzungen zu vermeiden. Dann öffnet man das Ventil A durch Zusammendrücken und drückt, während das Ventil gedrückt gehalten wird, die Luft aus dem Gummiball. Jetzt steht ein Unterdruck zur Verfügung, mit dem Flüssigkeit angesaugt werden kann. Das Ansaugen erfolgt durch kontrolliertes Zusammendrücken des Ventils S, das Ablassen von Flüssigkeit durch Betätigen von E. Die Pipette beim Entleeren mit der Spitze an die Gefäßwand halten.

Glaspipette: Vorsicht beim Ablesen der aufgezogenen Flüssigkeitsmenge! Regeln zum Ablesen des Meniskus beachten.

Titel: Materialien 2

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

im Uhrzeigersinn von oben: Glaspipette mit Peleusball, Küvetten zum Messen von Lösungen im Fotometer und unten eine Automatikpipette mit aufgesteckter Pipettenspitze

Automatikpipette: Eine im Labor sehr gebräuchliche Pipette ist die Mikroliter- oder Kolbenhubpipette. Diese Pipetten werden benutzt, um kleine Volumina und sehr kleine Volumina (von 5 ml = 5000 µl bis 0,1 µl) zu dosieren. Kolbenhubpipetten arbeiten nach dem Verdrängungsprinzip. Ein beweglicher Kolben verdrängt beim Herunterdrücken die unter ihm liegen Luftsäule, bzw. zieht die Luftsäule in der Aufwärtsbewegung mit sich nach oben, und dadurch auch die zu pipettierende Flüssigkeit in die aufgesteckte Pipettenspitze. Diese Pipetten arbeiten mit aufsteckbaren Pipettenspitzen, in welche die gewünschte Flüssigkeit aufgesaugt wird. Zum festen Aufstecken steckt man die Spitze auf die Pipette auf und dreht sie mit einer Vierteldrehung fest.

Küvette: Eine Küvette ist ein Gefäß mit planparallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. Küvetten gibt es in unterschiedlicher Qualität, je nach Verwendungszweck. Üblicherweise bestehen sie aus Glas oder Kunststoff. Für Wellenlängen, die unter 200 nm liegen, werden spezielle Quarzküvetten benötigt.

Peleusball: verfügt über drei Ventile für folgende Funktionen:

  • Ventil A (Ansaugen/Ausdrücken) oben: Luft ausdrücken zum Ansaugen
  • Ventil S (von Saugen) unten: flüssiges Medium in Pipette ansaugen
  • Ventil E (von Entleeren) seitlich: Pipetteninhalt kontrolliert abgeben

Anwendung: Zunächst wird der Peleusball auf die Pipette aufgesetzt. Dabei die Pipette kurz halten und waagerecht zum Körper, um Verletzungen zu vermeiden. Dann öffnet man das Ventil A durch Zusammendrücken und drückt, während das Ventil gedrückt gehalten wird, die Luft aus dem Gummiball. Jetzt steht ein Unterdruck zur Verfügung, mit dem Flüssigkeit angesaugt werden kann. Das Ansaugen erfolgt durch kontrolliertes Zusammendrücken des Ventils S, das Ablassen von Flüssigkeit durch Betätigen von E. Die Pipette beim Entleeren mit der Spitze an die Gefäßwand halten.

Titel: Zentrifuge

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Die Zentrifuge wird nur vom Betreuer beladen und bedient!