IVIAT

IVIAT

Die Durchführung der IVIAT-Technologie zur Identifizierung von in vivo exprimierten Genen im Verlauf einer APEC-Infektion beim Huhn erfordert zunächst die Herstellung einer induzierbaren Expressions-Bibliothek eines repräsentativen und virulenten APEC-Isolates und die Verfügbarkeit entsprechender Serumproben von Hühnern, die zuvor mit dem Infektionserreger konfrontiert waren. Für die Herstellung der Bibliothek werden pETabc Expressions-Vektoren (Novagen) verwendet, die die Klonierung von DNS-Inserts in allen drei Leserahmen unter transkriptionaler Kontrolle eines T7 Promoters ermöglichen. Das Hühner-Serum wird gepoolt und mit ganzen Zellen sowie auch zellulären Extrakten von in vitro kultivierten APEC-Stämmen absorbiert und das absorbierte Serum wiederum zur Überprüfung der Expressions-Bibliothek durch Western Blot eingesetzt. Dabei identifizierte positive Klone enthalten entsprechend ein DNS-Fragment des Erregers, das für ein in vivo induziertes Antigen kodiert. Sie können mithilfe eines Vektor-spezifischen Oligonukleotidprimers sequenzanalysiert und im weiteren Verlauf auf ihre Eignung als Vakzine-Kandidaten überprüft werden. Als Negativkontrolle wird ein apathogener E. coli-Stamm aviären Ursprungs mitgeführt und absorbiert, um nicht relevante Antigene herauszufiltern.

Wir konnten mit Hilfe der IVIAT-Methode bereits erste Gene identifizieren, die derzeit näher charakterisiert werden (Prävalenzstudien, Herstellung von Mutanten, Eignung als Vakzinekandidat).   

IVIAT

For the application of the IVIAT method to identify in vivo expressed genes during an APEC infection in chickens, an induced expression library has to be generated using a representative virulent APEC isolate, and the respective serum samples previously confronted with the pathogen is an important requirement. To generate the library, pETabc expression vectors (Novagen) are used that allow the cloning of DNA inserts in all three reading frames under the transcriptional control of a T7 promoter. The chicken serum is pooled together with whole cells and cell extracts from in vitro cultivated APEC strains, and absorbed. A western blot of the absorbed serum is performed to test the expression library. The positively identified clones contain the corresponding DNA segment of the pathogen that codes an in vivo induced antigen. These clones can be sequence analysed with the help of vector-specific oligonucleotide primers and then further tested as potential vaccine candidates. A non-pathogenic E. coli strain of avian origin serves as the negative control and is also absorbed to filter out any irrelevant antigens. Using IVIAT, preliminary data have identified genes that are being further characterized (Prevalence studies, Generation of mutants, Suitability as a vaccine candidate).

 

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Keywords

  • Freie Universitaet Berlin, department of veterinary medicine, institute for microbiology and epizootics