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Patch Clamp

Die Patch-Clamp-Technik ist eine Messmethode in der Elektrophysiologie, mit der sich heute der Strom durch einzelne Ionenkanäle in der Zellmembran einer Zelle darstellen lässt.

Die Bezeichnung Patch bezieht sich auf den kleinen Membranausschnitt (engl. patch: Flicken) unter der Patch-Pipette, die zugleich als Messelektrode dient.

Während der Messung wird der Membranpatch auf einem vorgegebenem Potential gehalten (engl. to clamp: befestigen, festklemmen). Der dafür notwendige winzige Strom liegt im pA Bereich und kann mit dem Patch-Clamp-Verstärker genau eingestellt  und gemessen werden.

Abhängig davon, ob nach dem Aufsetzen der Patch-Pipette dieser Membranbereich aus der Zelle herausgelöst oder an der intakten Zelle gemessen wird, werden bestimmte Konfigurationen in der Patch-Clamp-Technik unterschieden.

Mit Hilfe dieser Methode kann man direkt untersuchen, ob z.B. Pansenepithelzellen Proteine für die Leitung von NH4+ oder Acetat Anionen besitzen.

Whole-Cell-Konfiguration

Hier wird der Strom über die gesamte Zellmembran gemessen. Unter dem Mikroskop und mittels eines Mikromanipulators, wird eine Glaspipette auf die Zellmembran gesetzt. Durch Anlegen eines Unterdrucks wird ein Membranstückchen herausgesaugt und legt sich eng an die Glaswand der Pipette an.  Mit etwas Glück gelingt es, einen dichten „seal“ herzustellen. Jetzt kann durch etwas stärkeres Ansaugen dieses Membranstückchen durchbrochen werden und es besteht jetzt eine Verbindung zum Zytosol der Zelle, über die die Pipettenlösung in die Zelle diffundieren kann.

Über einen in die Glaspipette geschobenen Draht kann das Eigenpotential der Zelle gemessen oder aber die Spannung auf beliebige Werte geklemmt und der fließende Strom gemessen werden. Die Werte werden in der Regel in einer Strom-Spannungskurve aufgetragen um zu ermitteln, wie sich die Leitfähigkeit der Zelle mit dem Potential verändert.

Durch Variation der Messlösungen gelingt es so, herauszufinden, welche Ionen über die Zellmembran geleitet werden.  So kann man z.B. eine Lösung mit Ammonium oder Azetat applizieren und untersuchen, ob das Ammoniumion oder das Azetation geleitet wird. Dieser Konfigurationsansatz wird am Institut für Veterinär-Physiologie sowohl an nativen als auch an transfizierten Zellen, die bestimmte Kanalproteine überexprimieren, durchgeführt.

Inside Out Konfiguration

Wieder wird die Pipette auf die Zelle gesetzt; es wird ein Membranstückchen angesaugt.  Jetzt wird aber die gesamte Pipette nach oben bewegt.  Mit Glück bleibt das Membranstückchen in der Pipette hängen und die Leitfähigkeit auf verschiedene Ionen kann untersucht werden. Dabei sieht man typischerweise, wie Kanäle sich öffnen und schließen, so dass der Strom schlagartig zu- oder abnimmt und eine Art Treppenmuster entsteht. Jede Stufe entspricht der Leitfähigkeit eines Einzelkanals.

Anschließend kann man untersuchen, was passiert, wenn man z.B. Chlorid aus der Lösung entfernt. Nimmt der Strom ab, handelt es sich um einen Chloridkanal. Als nächstes kann untersucht werden, ob dieser Kanal auch andere Anionen leitet – z.B. Iod, oder Fluor – oder auch Acetat, das Anion der Essigsäure.



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