IVIAT

IVIAT

Die Durchführung der IVIAT-Technologie zur Identifizierung von in vivo exprimierten Genen im Verlauf einer APEC-Infektion beim Huhn erfordert zunächst die Herstellung einer induzierbaren Expressions-Bibliothek eines repräsentativen und virulenten APEC-Isolates und die Verfügbarkeit entsprechender Serumproben von Hühnern, die zuvor mit dem Infektionserreger konfrontiert waren. Für die Herstellung der Bibliothek werden pETabc Expressions-Vektoren (Novagen) verwendet, die die Klonierung von DNS-Inserts in allen drei Leserahmen unter transkriptionaler Kontrolle eines T7 Promoters ermöglichen. Das Hühner-Serum wird gepoolt und mit ganzen Zellen sowie auch zellulären Extrakten von in vitro kultivierten APEC-Stämmen absorbiert und das absorbierte Serum wiederum zur Überprüfung der Expressions-Bibliothek durch Western Blot eingesetzt. Dabei identifizierte positive Klone enthalten entsprechend ein DNS-Fragment des Erregers, das für ein in vivo induziertes Antigen kodiert. Sie können mithilfe eines Vektor-spezifischen Oligonukleotidprimers sequenzanalysiert und im weiteren Verlauf auf ihre Eignung als Vakzine-Kandidaten überprüft werden. Als Negativkontrolle wird ein apathogener E. coli-Stamm aviären Ursprungs mitgeführt und absorbiert, um nicht relevante Antigene herauszufiltern.
Wir konnten mit Hilfe der IVIAT-Methode bereits erste Gene identifizieren, die derzeit näher charakterisiert werden (Prävalenzstudien, Herstellung von Mutanten, Eignung als Vakzinekandidat).   

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