Bestimmung der Glucose-6-Phosphatase-Aktivität in einem Leberextrakt

Eine gepufferte Lösung von Glukose-6-Phosphat wird mit einem Leberextrakt bei 37ºC inkubiert. In definierten zeitlichen Abständen werden Proben entnommen und in kalte Trichloressigsäure (5%) pipettiert. Dadurch wird die Enzymreaktion abgestoppt. Das gefällte Protein wird abzentrifugiert und im Überstand wird die während der Reaktionszeit gebildete freie Glukose bestimmt. Aus den ermittelten Werten kann die Aktivität des Enzyms berechnet werden.

Die Glukosebestimmung erfolgt enzymatisch mit der Glukoseoxidase-Peroxidase-(GOD/POD)-Methode. Glukose wird durch die GOD zu Gluconolacton dehydriert und der Wasserstoff wird auf molekularen Sauerstoff übertragen. Dabei entsteht pro Molekül Glukose ein Molekül Wasserstoffperoxid.

Das Gluconolacton wird spontan zu Gluconsäure hydrolysiert. Wasserstoffperoxid oxidiert in einer durch Peroxydase (POD) katalysierten Reaktion den Wasserstoffdonator ABTS (2’2-Azino-di-3-ethylbenzthiozolin-sulfonsäure(6)-diammoniumsalz) zu einem grünen Farbstoff D.

Die Intensität des Farbstoffs ist der Glukosekonzentration proportional. Die Extinktion des Farbstoffs wird bei 578 nm gemessen.


Titel: Chemikalie Trichloressigsäure (TCA)

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Vorsicht: TCA ist eine starke organische Säure! Ätzend und umweltgefährlich


Titel: Fotometer

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

Das Fotometer (alte Schreibweise: Photometer) ist ein Instrument zur Lichtstärkenmessung. Es dient zur Bestimmung von Konzentrationen von Stoffen in Lösungen (Lambert-Beer'sches Gesetz).

Die Bedienung erfolgt durch den Assistenten.


Titel: Materialien

Quelle: Kutz-Lohroff, Bergbauer (Veterinär-Biochemie)

im Uhrzeigersinn von oben:

  • Glaspipette mit Peleusball
  • Reagenzglasständer mit Reagenzgläsern
  • Küvetten zum Messen von Lösungen im Fotometer
  • Automatikpipette mit aufgesteckter Pipettenspitze

Automatikpipette: Eine im Labor sehr gebräuchliche Pipette ist die Mikroliter- oder Kolbenhubpipette. Diese Pipetten werden benutzt, um kleine Volumina und sehr kleine Volumina (von 5 ml = 5000 µl bis 0,1 µl) zu dosieren. Kolbenhubpipetten arbeiten nach dem Verdrängungsprinzip. Ein beweglicher Kolben verdrängt beim Herunterdrücken die unter ihm liegen Luftsäule, bzw. zieht die Luftsäule in der Aufwärtsbewegung mit sich nach oben, und dadurch auch die zu pipettierende Flüssigkeit in die aufgesteckte Pipettenspitze. Diese Pipetten arbeiten mit aufsteckbaren Pipettenspitzen, in welche die gewünschte Flüssigkeit aufgesaugt wird. Zum festen Aufstecken steckt man die Spitze auf die Pipette auf und dreht sie mit einer Vierteldrehung fest.

Küvette: Eine Küvette ist ein Gefäß mit planparallelen Seitenflächen, das für optische Untersuchungen (UV/VIS-Spektroskopie) verwendet wird. Küvetten gibt es in unterschiedlicher Qualität, je nach Verwendungszweck. Üblicherweise bestehen sie aus Glas oder Kunststoff. Für Wellenlängen, die unter 200 nm liegen, werden spezielle Quarzküvetten benötigt.

Peleusball: verfügt über drei Ventile für folgende Funktionen:

  • Ventil A (Ansaugen/Ausdrücken) oben: Luft ausdrücken zum Ansaugen
  • Ventil S (von Saugen) unten: flüssiges Medium in Pipette ansaugen
  • Ventil E (von Entleeren) seitlich: Pipetteninhalt kontrolliert abgeben

Anwendung: Zunächst wird der Peleusball auf die Pipette aufgesetzt. Dabei die Pipette kurz halten und waagerecht zum Körper, um Verletzungen zu vermeiden. Dann öffnet man das Ventil A durch Zusammendrücken und drückt, während das Ventil gedrückt gehalten wird, die Luft aus dem Gummiball. Jetzt steht ein Unterdruck zur Verfügung, mit dem Flüssigkeit angesaugt werden kann. Das Ansaugen erfolgt durch kontrolliertes Zusammendrücken des Ventils S, das Ablassen von Flüssigkeit durch Betätigen von E. Die Pipette beim Entleeren mit der Spitze an die Gefäßwand halten.

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