Proteine

  • Bestimmung freier Aminosäuren mit Ninhydrin

Die Menge der freien Aminosäuren im Blut variiert mit dem zeitlichen Abstand von der Nahrungsaufnahme und dem Proteingehalt der Nahrung. Zu einer starken Erhöhung der Aminosäurekonzentration des Blutes kann es bei einem akuten Leberschaden (reduzierte Desaminierungsrate) kommen. Unter dem Einfluss anaboler Hormone (Wachstumshormone, Insulin) sinkt der Aminosäurespiegel.

Die gängigste Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Aminosäuren (z.B. im Blutplasma) ist die Ninhydrinreaktion. Aufgrund ihres gleichartigen Aufbaus lassen sich alle a-Aminocarbonsäuren mittels der Ninhydrinreaktion nachweisen bzw. quantitativ bestimmen. Für die Pyrrolidincarbonsäure Prolin gilt dies nicht. Ninhydrin reagiert mit den primären Aminogruppen, wobei nach Dimerisierung ein typischer rot-blauvioletter Farbstoff (Ruhemanns Purpur) entsteht. Die Extinktion dieses Farbstoffes kann bei 570 nm gemessen werden. In der Reaktion wird die Aminosäure decarboxyliert und die Aminogruppe auf Ninhydrin übertragen, wobei aus der Aminosäure ein Aldehyd hervorgeht. Das nun entstandene primäre Amin reagiert dann mit einem weiteren Molekül Ninhydrin, wodurch der Farbstoff Ruhemanns Purpur entsteht. Da Prolin eine sekundäre Aminogruppe enthält (2 C an N gebunden), kann die Aminogruppe nicht auf Ninhydrin übertragen werden, es entsteht das gelb gefärbte Additionsprodukt aus einem Molekül Ninhydrin und Prolin.

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Die Farbreaktion wird häufig zur Visualisierung von Aminosäuren nach chromatografischen oder elektrophoretischen Methoden benutzt. Die Ninhydrin-Reaktion kann aber auch zur Visualisierung von Fingerabdrücken in der Forensik dienen. Der Hautschweiß enthält kleine Mengen freier Aminosäuren und Proteine, welche mittels Ninhydrin angefärbt werden können. Eine weitere Anwendung ist der Nachweis freier Aminosäuren im Blutplasma. Im Versuch soll die Konzentration einer unbekannten Aminosäurelösung anhand eines Standards bestimmt werden. Die unbekannte Aminosäurelösung simuliert dabei ein Blutplasma, das durch die Fällung seiner Proteine zuvor enteiweißt worden ist.

  • Bestimmung der Arginaseaktivität in der Leber

Von so genannten ureotelen Lebewesen wird Aminosäurenstickstoff hauptsächlich in Form von Harnstoff ausgeschieden. Die beiden Stickstoffatome des Harnstoffs stam-men von zwei Vorläufern ab: dem Ammoniumion und der Aminosäure Aspartat. Der Weg des Aminosäurenstickstoffs geht aus folgendem Schema hervor:

Aminosäure-N wird zu Glutamat-N;

Glutamat-N spaltet sich auf in Aspartat-N und Ammoniumion und diese bilden Harnstoff-N

Die Harnstoffsynthese läuft in der Leber ab. Der letzte Schritt der Harnstoffsynthese ist die Arginasereaktion, in deren Verlauf Arginin zu Ornithin und Harnstoff hydrolysiert wird.

Versuchsaufbauten:

Skript zum Versuch Proteine (pdf)

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